單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）技術(shù)的發(fā)展為我們揭示眼科學(xué)中的細(xì)胞類型、細(xì)胞發(fā)育和分化過程以及細(xì)胞間相互作用等重要生命現(xiàn)象提供了新的研究視角。然而，在眼科領(lǐng)域進(jìn)行單細(xì)胞全長轉(zhuǎn)錄組研究時仍面臨一些挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)主要采用基于短讀長的RNA測序方法，雖然可以定量描述基因表達(dá)水平，但無法精細(xì)區(qū)分基因不同異構(gòu)體。而在眼科領(lǐng)域，了解RNA可變剪切在眼發(fā)育、分化以及眼疾病發(fā)生發(fā)展等過程中的關(guān)鍵調(diào)控作用至關(guān)重要。

為了解決這些問題，單細(xì)胞全長轉(zhuǎn)錄組技術(shù)應(yīng)運而生。這些新一代測序技術(shù)，如PacBio和Nanopore，可以直接測序全長轉(zhuǎn)錄本，從而提供更全面的轉(zhuǎn)錄信息。然而，目前該技術(shù)在眼科領(lǐng)域的應(yīng)用還相對較少，主要是由于低通量和高測序錯誤率等限制，通常只能處理少量細(xì)胞，限制了對眼科組織中多種細(xì)胞類型的全面分析，也無法捕捉到低豐度的轉(zhuǎn)錄本信息，極大限制了該技術(shù)的應(yīng)用。因此，推動單細(xì)胞全長轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的發(fā)展將為我們更好地理解眼部組織的細(xì)胞異質(zhì)性、發(fā)育過程以及疾病機制提供重要的技術(shù)手段。

最近，中山大學(xué)中山眼科中心劉奕志/肖傳樂團隊于2023年5月6日在Nature Communications雜志上聯(lián)合發(fā)表題為“High-throughput and high-accuracy single-cell RNA isoform analysis using PacBio circular consensus sequencing”的研究論文，該項研究通過多個RNA鏈接建庫，建立了高通量的全長單細(xì)胞RNA測序方法（HIT-scISOseq），在保持測序精度前提下，突破性將單細(xì)胞全長RNA測序的通量提高到了一個新水平。

圖1.HIT-scISOseq實驗流程示意圖和技術(shù)效果

該研究應(yīng)用HIT-scISO-seq對食蟹猴角膜緣組織細(xì)胞進(jìn)行分析，在RNA異構(gòu)體水平，高度重現(xiàn)了已知的細(xì)胞類型特征（圖2），同時也發(fā)現(xiàn)了大量細(xì)胞特異的marker isoform，以及揭示了角膜緣組織細(xì)胞特異的RNA異構(gòu)體剪切和表達(dá)模式?？偟膩碚f，這項研究建立的HIT-scISOseq技術(shù)，能夠高通量、高精度研究單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體，提供更全面的轉(zhuǎn)錄特征信息，極大提高了研究者們在各種生物學(xué)過程中開辟新的科學(xué)發(fā)現(xiàn)的可能性。

圖2.食蟹猴角膜緣組織單細(xì)胞RNA異構(gòu)體表達(dá)圖譜

HIT-scISOseq技術(shù)的引入會為眼科學(xué)單細(xì)胞研究帶來重要進(jìn)展。該技術(shù)的創(chuàng)新性在于通過連接技術(shù)結(jié)合PacBio HiFi長讀長的測序優(yōu)勢，實現(xiàn)了單細(xì)胞全長RNA測序的高通量化，顯著提高了數(shù)據(jù)的可靠性和全面性。在食蟹猴角膜緣組織細(xì)胞解析中的應(yīng)用進(jìn)一步證明了該技術(shù)在眼科學(xué)基礎(chǔ)研究和臨床研究中的潛力。HIT-scISOseq技術(shù)是一項通用的技術(shù)，能夠在未來的眼部疾病研究中，對眼部組織中不同細(xì)胞類型的RNA異構(gòu)體進(jìn)行全面的分析，深入了解疾病的發(fā)病機制和分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及發(fā)現(xiàn)潛在的治療靶點，為靶向治療和新藥開發(fā)提供新的方向和目標(biāo)。