板層狀魚鱗病（lamellar ichthyosis，下文簡稱LI）是一種罕見的遺傳病，目前尚無有效治愈方法。若父母攜帶LI缺陷基因，目前僅能通過早期胚胎診斷來阻止患兒的出生。如果能在胚胎層面修復(fù)有遺傳缺陷的基因，LI這種遺傳疾病是否能夠被阻斷呢？

近期，廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院劉見橋教授團(tuán)隊聯(lián)合上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院童國慶教授團(tuán)隊、上?？萍即髮W(xué)李廣磊博士團(tuán)隊在國際知名期刊《Molecular Therapy》 （IF11.454）上共同發(fā)表一項最新研究成果（Correction of the pathogenic mutation in TGM1 gene by adenine base editing in mutant embryos，PMID： 33974999），利用腺嘌呤堿基編輯器高效修復(fù)TGM1型板層狀魚鱗病胚胎的致病基因。這一成果是腺嘌呤編輯系統(tǒng)用于人類胚胎修復(fù)的全球首次報道，給臨床上修復(fù)致病胚胎、以及PGT檢測無正常胚胎患者帶來新希望。

生育受限，修復(fù)缺陷基因阻斷罕見遺傳病

板層狀魚鱗?。↙I）是一種常染色體隱性遺傳病，臨床表現(xiàn)為皮疹為大的灰棕色鱗屑，全身彌漫性紅斑等，受感染的新生兒出生時通常包有火棉膠樣。該病發(fā)病率約1/20萬，屬于罕見的遺傳病，該病不會致死，但患者生活質(zhì)量非常差，且目前沒有有效的治療手段。

LI是一種遺傳異質(zhì)性疾病，與ABCA12、ALOXE3、ALOX12B、TGM1等基因相關(guān)，其中TGM1基因編碼的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶-1是參與形成并維持角化包膜的關(guān)鍵酶，TGM1基因突變是導(dǎo)致板層狀魚鱗病的主要原因。

目前，由于對LI的治療沒有有效辦法，想要阻斷該疾病，只能在攜帶致病基因的夫妻雙方上，通過體外受精獲得胚胎，在植入前對胚胎進(jìn)行遺傳學(xué)檢測（PGT），以篩選健康的胚胎移植。但是，為篩選出健康的胚胎，PGT檢測對形成囊胚的數(shù)量和質(zhì)量提出了更高的要求，這也讓一些獲卵少、無囊胚形成的患者望而止步?；诖?，研究人員一直在研究如何通過基因編輯技術(shù)，在胚胎層面精準(zhǔn)修復(fù)LI的致病基因，從而實現(xiàn)修復(fù)患病胚胎的目的。

執(zhí)著探索，科研團(tuán)隊利用基因編輯技術(shù)修復(fù)胚胎突變基因

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院劉見橋教授團(tuán)隊聯(lián)合上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院童國慶教授團(tuán)隊、上海科技大學(xué)李廣磊博士團(tuán)隊利用兩種腺嘌呤堿基編輯系統(tǒng)校正板層魚鱗病TGM1突變基因，通過全基因組測序、深度測序和RNA測序驗證了基因修復(fù)的有效性和安全性。

在一次偶然的機(jī)會下，科研團(tuán)隊遇到一對多次流產(chǎn)的夫婦。夫婦二人一路奔波，尋醫(yī)問藥無果。聽從醫(yī)生建議后，夫婦做了相關(guān)檢查，發(fā)現(xiàn)二人均為板層狀魚鱗病基因TGM1C607T突變的攜帶者，這也解釋了妻子多次流產(chǎn)的原因。在征得夫婦二人的知情同意后，團(tuán)隊保存了他們的遺傳標(biāo)本，為尋找治療辦法做準(zhǔn)備。

根據(jù)疾病基因特點，科研團(tuán)隊首先構(gòu)建TGM1C607T細(xì)胞模型，對比4種堿基編輯器：BEmax-AID、BEmax-A3A-Y130F、AncBE4max、AncBEmax-NG在編輯靶基因和非靶基因的編輯效率，最后選擇BEmax-A3A-Y130F和mt-sg1來構(gòu)建基因缺陷型細(xì)胞系，獲得100%編輯位點和0%非編輯位點的細(xì)胞系。接下來利用ABEmax-NG和Sc-ABEmax腺嘌呤堿基編輯器和不同長度的single guide RNA（sgRNA）對突變細(xì)胞系進(jìn)行修復(fù)。

那么，摸索好的組合是否可以糾正患病胚胎呢？帶著這個疑惑，團(tuán)隊利用患者捐獻(xiàn)的精子與不成熟卵成熟后，受精成為疾病攜帶型胚胎（患病胚胎），再分別將ABEmax-NG和Sc-ABEmax與對應(yīng)的sgRNA組合注射進(jìn)胚胎（圖1）。

在實驗后，經(jīng)高通量深度測序，發(fā)現(xiàn)修復(fù)方案有約80%的修復(fù)效率（圖2）。全基因組測序及潛在脫靶位點深度測序都表明兩種修復(fù)方案的安全性（圖3）。這意味著，利用腺嘌呤基因編輯成功修復(fù)了人類胚胎板層狀魚鱗病致病基因。

（圖1▲ 技術(shù)流程圖）

（圖2▲ 矯正人類胚胎中的致病突變基因）

（圖3▲修復(fù)后胚胎的安全性評價）

與時俱進(jìn)，基因編輯技術(shù)的臨床應(yīng)用仍需研究

該研究利用腺嘌呤堿基編輯器糾正TGM1基因點突變異常導(dǎo)致的板層狀魚鱗病胚胎，腺嘌呤堿基編輯器DNA脫靶少，RNA的脫靶也通過不斷優(yōu)化的蛋白進(jìn)行了降低，安全性得到了提高，應(yīng)用前景巨大。這也是腺嘌呤編輯系統(tǒng)用于人類胚胎修復(fù)的全球首次報道！

罕見遺傳病種類繁多，是人類醫(yī)學(xué)面臨的巨大挑戰(zhàn)之一，給患者和家庭帶來巨大的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，同時大概率傳給下一代，常規(guī)方法難以治愈。目前，中國罕見病患者可能超過1600萬，有75%的罕見病見于孩童時期，近80%的罕見病是由于基因缺陷所致。若父母雙方都是缺陷基因的攜帶者，他們?nèi)绾卧杏】档暮蟠鷮⑹且粋€巨大的難題。

基因治療在源頭上對基因進(jìn)行修復(fù)，修復(fù)致病基因獲得健康胚胎。隨著基因編輯技術(shù)的不斷發(fā)展，其可靠性，安全性越來越高，治療成本不斷降低，為其將來走向臨床打下堅實的基礎(chǔ)。但是，基因編輯技術(shù)還受到倫理問題和相關(guān)法律法規(guī)的限制，以及研究可靠性、安全性的驗證等不少挑戰(zhàn)，距離臨床應(yīng)用尚需更多研究。