“這里是與病毒‘零距離’接觸的地方，整個(gè)實(shí)驗(yàn)室完全密封，室內(nèi)處于負(fù)壓狀態(tài)，我們喜歡用‘三流’來形容它，即人流、物流、氣流的單向流動(dòng)，確保在里面的污染物不會(huì)泄漏到外面而造成污染。” 廣東省第二人民醫(yī)院P3實(shí)驗(yàn)室主任林劍國說，而“這里”指的就是P3實(shí)驗(yàn)室。省二醫(yī)每天400多份新冠肺炎核酸檢測(cè)就是在這里開展的。

現(xiàn)在，讓我們一起來揭開省二醫(yī)P3實(shí)驗(yàn)室的神秘面紗，看看病毒究竟在P3實(shí)驗(yàn)室是怎樣被“揪出來”的？

P3實(shí)驗(yàn)室主任林劍國博士

譽(yù)為“偵察兵”的檢測(cè)團(tuán)隊(duì)

揭秘一：前世今生

P3實(shí)驗(yàn)室是生物安全防護(hù)三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，P是Protection的縮寫。整個(gè)實(shí)驗(yàn)室完全密封，室內(nèi)處于負(fù)壓狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部的氣體不會(huì)泄漏到外面而造成污染，也就是“氣流”的單項(xiàng)流動(dòng)。

根據(jù)微生物及其毒素的危害程度不同，生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室分為四級(jí)，一級(jí)最低，四級(jí)最高。一級(jí)實(shí)驗(yàn)室一般適用于對(duì)健康成年人無致病作用的微生物；二級(jí)適用于對(duì)人和環(huán)境有中等潛在危害的微生物；三級(jí)適用于主要通過呼吸途徑使人傳染上嚴(yán)重的甚至是致死疾病的致病微生物或其毒素；四級(jí)適用于對(duì)人體具有高度的危險(xiǎn)性，通過氣溶膠途徑傳播或傳播途徑不明、尚無有效疫苗或治療方法的致病微生物或其毒素。省二醫(yī)新冠病毒核酸檢測(cè)就是在P3實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的。

揭秘二：抽絲剝繭

核酸檢測(cè)是確診新冠肺炎的“金標(biāo)準(zhǔn)”，而檢測(cè)流程中的每一個(gè)環(huán)節(jié)都是精細(xì)活，容不得半點(diǎn)馬虎。在操作中，實(shí)驗(yàn)員面對(duì)眼前的樣本，需要“一個(gè)一個(gè)地揭開蓋子，開蓋加樣和核酸提取”，這無疑是與“病毒”正面交鋒。

實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的檢測(cè)流程可分為5個(gè)步驟：樣本進(jìn)入“傳遞窗”——滅活處理——開蓋加樣和核心提取——擴(kuò)增反應(yīng)判斷結(jié)果——高壓滅菌。

1、樣本進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室——“傳遞窗”隔離空氣

圖一 “傳遞窗”也叫做Air Lork（空氣鎖）

采集的檢測(cè)樣本如咽拭子或肛拭子，在進(jìn)入P3實(shí)驗(yàn)室前得先進(jìn)入一個(gè)特殊的窗口——“傳遞窗”，這個(gè)窗口也叫做Air Lork，空氣鎖。顧名思義，與空氣有關(guān)，這個(gè)傳遞窗有不能同時(shí)打開的雙重門，保證傳遞樣本時(shí)帶進(jìn)去的空氣被隔離在雙重門中，保證實(shí)驗(yàn)室外的環(huán)境不受污染。這也是“三流”中“物流”，樣本的命運(yùn)起點(diǎn)，在這里開啟它在實(shí)驗(yàn)室中短暫的一生。

2、檢測(cè)前的滅活處理——相對(duì)安全

樣本在水浴箱經(jīng)半個(gè)小時(shí)56℃高溫滅活，這樣會(huì)使病毒蛋白不再有生理活性，失去感染、致病和繁殖能力，在對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)時(shí)相對(duì)安全，但是病毒蛋白的基因序列并沒有受到影響。

3、檢測(cè)的核心環(huán)節(jié)——進(jìn)行開蓋加樣和核酸提取

標(biāo)本處理間，在這里進(jìn)行開蓋加樣和核酸提取

省二醫(yī)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部副主任技師胡亮杉是進(jìn)入P3負(fù)壓實(shí)驗(yàn)室完成設(shè)備調(diào)試、程序設(shè)定、試劑試用等前期準(zhǔn)備工作的第一人。據(jù)她介紹，在標(biāo)本處理間，實(shí)驗(yàn)員拿到滅活后的樣本時(shí)，第一個(gè)動(dòng)作就是振蕩，盡量讓拭子上的病毒洗脫在培養(yǎng)基溶液中，再靜置五分鐘進(jìn)行沉淀。

接下來就是開蓋加樣，必須人手操作，而且需要兩個(gè)人高度配合才能完成，一人擰開樣本罐蓋子，另一人拿著微量移液器在樣本罐中吸取微量溶液，放到另一個(gè)提取管里，一個(gè)樣本對(duì)應(yīng)一個(gè)提取管，再擰上管蓋。就這樣，400多份樣本要打開瓶蓋吸取轉(zhuǎn)移400多次，每一次都是實(shí)驗(yàn)員與病毒面對(duì)面的“開撕”。

“樣本在開蓋轉(zhuǎn)移的過程中，病毒非常容易暴露在實(shí)驗(yàn)室的空氣中，近在咫尺，與我們幾乎就是零距離的接觸了?！焙辽颊f，“開蓋加樣的時(shí)候，拿著微量移液器的手往往因?yàn)榇髦p重手套，而顯得有些笨拙，可又不得不小心翼翼，再加上眼罩、面屏和生物安全柜玻璃窗的三重阻隔，所有動(dòng)作都顯得緩慢，手也因?yàn)閯?dòng)作的緩慢勞累而不時(shí)顫抖，經(jīng)常是左手扶著右手完成加樣的。”

人工核酸提取的步驟更是復(fù)雜，考驗(yàn)的是需要實(shí)驗(yàn)員的耐心與謹(jǐn)慎。“核酸提取可以使用儀器輔助，但由于比對(duì)的需要，往往要加以人工操作，需要反復(fù)進(jìn)行離心、加試劑、洗滌等10多個(gè)步驟，其中需要打開管蓋的操作就達(dá)7次以上，完成一例人工核酸提取要50分鐘左右?！焙辽颊f。

4、 擴(kuò)增反應(yīng)——45個(gè)循環(huán)繪制熒光曲線判斷結(jié)果

通過核酸擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)

根據(jù)曲線和參數(shù)分析判斷結(jié)果

提取的核酸送到核酸檢測(cè)室內(nèi)，就要上儀器了。提取的核酸加入到擴(kuò)增試劑中，通過熒光PCR儀進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，先將提取的核酸逆轉(zhuǎn)錄成DNA，再以DNA為模版，對(duì)特定位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增，利用不同的溫度進(jìn)行變性、退火和延伸，每個(gè)循環(huán)采集熒光值，45個(gè)循環(huán)后繪制熒光曲線，用時(shí)約110分鐘，實(shí)驗(yàn)員根據(jù)熒光曲線分析判斷結(jié)果的陰性和陽性。

5、污染物的高壓滅菌處理

實(shí)驗(yàn)過程產(chǎn)生的污物通過高壓滅菌后，按相關(guān)普通醫(yī)療垃圾處理?！拔锪鳌钡慕K點(diǎn)在這里就結(jié)束了。

產(chǎn)生的污物高壓滅菌后處理

揭秘三：傾柯衛(wèi)足

“三流”中的“人流”又是什么？來看看工作人員是如何工作的。

首先在清潔區(qū)內(nèi)穿戴中級(jí)防護(hù)服——通過緩沖間進(jìn)入到實(shí)驗(yàn)室內(nèi)負(fù)壓工作間，在這里進(jìn)行標(biāo)本處理，核酸提取及檢測(cè)——完畢后進(jìn)行空間、表面消毒，按順序脫下防護(hù)服——通過淋浴間更衣后，回到清潔區(qū)。這些步驟一個(gè)都不能少！

通過緩沖間進(jìn)入到實(shí)驗(yàn)室內(nèi)

核酸檢測(cè)的主要宗旨是高效、有序和安全。為了確保安全，省二醫(yī)采取了多種措施，第一，人員的篩選；第二，崗前進(jìn)行安全培訓(xùn)；第三，進(jìn)行嚴(yán)格的消毒滅菌制度；第四，感控督導(dǎo)員制度。到目前為止，P3實(shí)驗(yàn)室未出現(xiàn)過生物安全問題，當(dāng)然也與平時(shí)訓(xùn)練有關(guān)。

穿著三級(jí)防護(hù)裝備

揭秘四：棄偽存真

任何一個(gè)環(huán)節(jié)都不能忽視，任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題都可能導(dǎo)致“假陰性”或“假陽性”。因此，為保障檢測(cè)的質(zhì)量，檢測(cè)結(jié)果將經(jīng)歷重重的比對(duì)與復(fù)核。

據(jù)介紹，檢測(cè)質(zhì)量的保障措施在檢測(cè)前就已經(jīng)開始了，樣本采集的醫(yī)務(wù)人員必須經(jīng)過嚴(yán)格的培訓(xùn)和考核才能上崗，樣本的質(zhì)量與采集的技術(shù)密切相關(guān)，每一幀動(dòng)作流程都必須按規(guī)定進(jìn)行，樣本采集完后的護(hù)送工作都需按照嚴(yán)密的程序，由專人專道配送到實(shí)驗(yàn)室。

在檢測(cè)過程中，實(shí)驗(yàn)員謹(jǐn)慎進(jìn)行每一次測(cè)試，針對(duì)可疑樣本，選用不同的試劑進(jìn)行復(fù)核確定，以防止“假陰性”的出現(xiàn)；其次，每進(jìn)行一批實(shí)驗(yàn)，均會(huì)隨機(jī)插入三個(gè)以上空白對(duì)照，針對(duì)陽性樣本會(huì)進(jìn)行病毒基因的測(cè)序比對(duì)，以防止“假陽性”的出現(xiàn)。

檢測(cè)后，定期隨機(jī)抽取檢測(cè)后的樣本送第三方實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比分析，同時(shí)也參加衛(wèi)生部和廣東省臨床中心的室間質(zhì)評(píng)，保障檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

揭秘五：所向披靡

P3檢測(cè)團(tuán)隊(duì)目前有21人，實(shí)行一天三班制。實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)格遵照“新型冠狀病毒肺炎診療方案”及生物安全要求，檢測(cè)人員需在P3實(shí)驗(yàn)室負(fù)壓密閉的空間里穿著三級(jí)防護(hù)裝備，5個(gè)小時(shí)不吃不喝，甚至穿戴成人紙尿褲以解決上廁所的需要。不僅如此，檢測(cè)人員還要克服心理上的恐懼。咽拭子樣本是從疑似患者鼻咽部采集，可能含有較多新冠病毒，檢測(cè)人員從采樣罐里拿出樣本時(shí)，在這樣密閉的環(huán)境中很容易借助空氣傳播，但他們依然無怨無悔地戰(zhàn)斗在前線，把好第一道關(guān)。

“他們與戰(zhàn)斗在病房里的醫(yī)護(hù)人員不同，他們藏在實(shí)驗(yàn)室里，每天與病毒近距離接觸，是別人看不見的‘最前線’?！笔《t(yī)P3主任林劍國說。

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